主诉

患者编号RC，男性，33 岁，汉族。

既往史

多个牙区龋坏两年，无既往系统病病史。

个人史

有饮用冰红茶、凉茶习惯（每日1~2瓶）；

查体

口腔检查：33牙、42牙深龋；11~17牙、21~28牙、34~38牙、43~47牙残根。 取样方法取样全菌斑（A）、龋损（Q）、唾液（T，少，取样困难）、黏膜（N）样本，采集前嘱受检者温开水轻轻漱去口中的食物残渣。**菌斑样本置于含1 mL无菌转运液的EP管中，管口用0.2 mL石蜡油封闭，置于冰上，30 min内转运接种。（1）唾液样本收集：采集受检人非**性唾液3 mL；（2）全菌斑收集：在棉卷隔湿下用龈上刮治器刮取全口龈上菌斑，吹干牙面，再刮取龈下菌斑，**在一起；（3）龋损菌斑：用刮治器刮取龋损处**菌斑样本；（4）口腔黏膜拭子：手持采样拭子伸进口腔一侧，在内壁黏膜旋转10~15圈，然后再上下移动刮拭5~10次，力度适中，以紧贴口腔内壁黏膜为宜，确保采样拭头各处都能蘸取口腔黏膜脱落细胞；将采样拭子手柄折断弃去，采样头放入采样试管内。 1.2.2 细菌分离培养鉴定 将菌斑和黏膜样本在振荡器反复震荡混匀，弃棉签头备用。4种样本原代涂片镜检，革兰染色观察，并拍照。取原代样本20 μL用三角推棒均匀涂布于选择培养基科马嘉平板、轻唾培养基平板（MS）、Rogosa 平板用于选择培养念珠菌、链球菌和乳杆菌。将样本采用BHI培养基10倍连续梯度稀释法，将稀释度为10-2~10-6的样本20 μL用三角推棒均匀涂布于BHI血平板，放入37 ℃厌氧环境培养24~48 h。记录血平板中菌落外形、颜色、透明度、光泽、凸度、硬度、边缘、溶血情况，挑取外形不同的菌落传代分离培养，采用梅里埃生化鉴定仪和16S rDNA序列进化分析联合鉴定未知细菌。 1.2.2.1 梅里埃生化鉴定仪 根据细菌初步革兰染色特征选择鉴定卡片（GN/GP/NH/ANC等），并根据说明书要求将培养了18~24 h的菌苔用0.45%专用生理盐水配制成规定浊度的菌悬液，利用梅里埃全自动细菌鉴定仪（Vitek2 compact system，美国）进行鉴定，读取结果。 1.2.2.2 16S rDNA序列进化分析 挑取适量菌苔，按照细菌DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京，中国）说明书的步骤提取细菌DNA。用通用引物27F和1492R扩增16S rDNA基因序列，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带约为1.5 kb，送PCR产物至上海生工测序。将测序所得的拼接序列与HOMD（humanoral microbiome database）数据库和EzTaxon 数据库（EzTaxon server 2.1）中的国际标准模式菌株进行BLAST序列比对，根据进化树获得亲缘关系最近、相似度最高的菌种名称。 1.2.3 细菌DNA 水平检测 提取四种样本的全菌DNA；另选取既往提取的年龄相当，性别男性的两例健康志愿者（H1，H2）和两例猖獗龋患者（RC1，RC2）DNA，进行变异链球菌的相对含量检测和微生物组结构分析。 1.2.3.1 qPCR检测变异链球菌相对含量 使用BioRadCFX96 荧光定量PCR 仪，按照SYBR Green I（TaKaRa，中国）嵌合荧光法进行qPCR扩增，获得各目的基因产物的Cq值，并计算相对含量。 1.2.3.2 DGGE 分析微生物组结构 使用引物Bac1（5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTACGT-GCCAGCAGCC-3'）、Bac2（5'-GGACTACCAGGGTATCTACTAATCC-3'）进行常规PCR，使用Bio-Rad D-Code system（Bio-Rad公司，美国）对PCR 扩增产物进行变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）电泳。丙烯酰胺凝胶质量分数为8%，变性剂浓度梯度质量分数为40%~60%（100%变性剂包含体积分数为40%的甲酰胺与7 mol/L的尿素），变性胶上表面加入5 mL无变性作用的积层凝胶。60 V恒定电压、58 ℃条件下，在1×TAE缓冲液（pH=8.5）中电泳16 h。电泳完成后，采用0.5 μg/mL溴化乙锭染色15 min，然后用1×TAE缓冲液漂洗去除多余染料，凝胶成像系统采集并记录DGGE 凝胶的数码图。切取差异条带放入装有TAE的EP管中，溶胶后获取DNA，经测序PCR后送上海生工测序。 1.2.4 统计学分析 采用SPSS20.0 统计学软件的ANOVA方法及Image J软件分析实验结果。P